Sin embargo, a pesar de que la cromatograf\u00eda HILIC se ha afianzado como una t\u00e9cnica potente y efectiva para casos dif\u00edciles de separaci\u00f3n de compuestos, tambi\u00e9n presenta ciertos problemas como la mala reproducibilidad y las dificultades a la hora de solubilizar las muestras y los aditivos utilizados en las fases m\u00f3viles con alto contenido de disolvente org\u00e1nico. Debido a ello, el desarrollo de m\u00e9todos anal\u00edticos HILIC requiere conocer muy bien las particularidades de la t\u00e9cnica y sus diferencias con respecto a la cromatograf\u00eda de fase reversa.<\/p>\n La Cromatograf\u00eda de Interacci\u00f3n Hidrof\u00edlica, se diferencia de la cromatograf\u00eda l\u00edquida de fase reversa, fundamentalmente en que se utiliza una fase estacionaria polar e hidrof\u00edlica<\/strong> La fase m\u00f3vil, por su parte, es de naturaleza altamente org\u00e1nica <\/strong>(m\u00e1s del 60% de solvente, t\u00edpicamente acetonitrilo) que contiene un peque\u00f1o porcentaje de solvente acuoso o tamp\u00f3n, as\u00ed como cualquier otro solvente polar. Esta combinaci\u00f3n, permite que la fase m\u00f3vil forme una capa rica en agua adsorbida a la superficie polar de la fase estacionaria.<\/p>\n En este contexto, los analitos polares \u2013 sustancias con afinidad por el agua – tender\u00e1n a distribuirse por esa capa de la fase estacionaria, reteni\u00e9ndose en ella<\/strong> debido a la combinaci\u00f3n de diferentes tipos de mecanismos:<\/p>\n Ahora bien, a la hora de implementar la t\u00e9cnica HILIC en el laboratorio hay que tener en cuenta una serie de procedimientos que garanticen la mejor ejecuci\u00f3n y la elecci\u00f3n correcta de la columna es lo primero. Como se tiene que garantizar la polaridad y el factor hidrof\u00edlico de esta fase estacionaria, la elecci\u00f3n entre los diferentes tipos de fases estacionarias disponibles -silica, zwitterioic, amide, aminopropil\u2026etc.)\u00a0\u00a0 va a afectar a la selectividad del m\u00e9todo cromatogr\u00e1fico, por lo que las referencias bibliogr\u00e1ficas previas pueden ayudar a limitar la imprescindible fase de \u201censayo-error\u201d.<\/p>\n Tambi\u00e9n ser\u00e1 importante realizar una buena elecci\u00f3n de la fase m\u00f3vil. El solvente fuerte en este caso es el agua; el solvente d\u00e9bil ser\u00e1 org\u00e1nico y necesariamente miscible con agua. El m\u00e1s habitual es el acetonitrilo<\/strong> (ACN), siendo posible a\u00f1adir metanol o alcoholes para conseguir mejoras en la selectividad para determinadas aplicaciones.<\/p>\n Otra ventaja significativa de la HILIC es la baja contrapresi\u00f3n por la baja viscosidad<\/strong> de las fases m\u00f3viles ricas en materia org\u00e1nica que resulta en tiempos de an\u00e1lisis m\u00e1s r\u00e1pidos. Esto es particularmente relevante cuando se utilizan columnas con tama\u00f1o de part\u00edculas de menos de 2 micr\u00f3metros, ya que una contrapresi\u00f3n m\u00e1s baja permite el uso de flujos altos en columna. Adem\u00e1s, el efecto de calentamiento por fricci\u00f3n, que puede ser perjudicial en condiciones de reversa con part\u00edculas peque\u00f1as, no es un problema en HILIC porque la presi\u00f3n es generalmente 2 o 3 veces menor.<\/p>\n Adem\u00e1s, HILIC permite inyectar directamente extractos en solventes org\u00e1nicos apr\u00f3ticos obtenidos con protocolos de \u201csample clean-up\u201d en fase s\u00f3lida, <\/strong>sin la necesidad de secado y reconstituci\u00f3n en la fase m\u00f3vil; adem\u00e1s permite la separaci\u00f3n de cationes, aniones y neutros polares en una sola inyecci\u00f3n, ofreciendo un rendimiento de espectrograf\u00eda de masas igual o superior al de cromatograf\u00eda l\u00edquida en fase reversa.<\/p>\n Sin embargo, la Cromatograf\u00eda L\u00edquida de Interacci\u00f3n Hidrof\u00edlica (HILIC) presenta ciertos problemas que pueden afectar su rendimiento, tales como la reproducibilidad o la dificultad de\u00a0 re-equilibrado. Sin embargo, cada una de esas dificultades o problem\u00e1ticas pueden ser resueltos siguiente el ajuste adecuado:<\/p>\n Finalmente, si la causa del problema est\u00e1 relacionada con la interacci\u00f3n con sitios activos en el acero inoxidable del sistema, concretamente con la adherencia f\u00e1cil del analito, ser\u00e1 necesario considerar un lavado con \u00e1cido fosf\u00f3rico o n\u00edtrico o bien cambiar a un sistema de HPLC inerte dise\u00f1ado para minimizar interacciones inespec\u00edficas, frecuentes en biomol\u00e9culas.<\/li>\n Finalmente, el problema con la forma del pico puede tener origen en que exista una baja concentraci\u00f3n del tamp\u00f3n de pH de la fase m\u00f3vil. Ahora bien, aunque es cierto que a\u00f1adir m\u00e1s tamp\u00f3n puede mejorar la forma del pico, hay que tener en cuenta que tambi\u00e9n puede afectar a la sensibilidad en espectrograf\u00eda de masas (MS) y a la estabilidad de la l\u00ednea base en ELSD y UV.<\/li>\n Aunque la Cromatograf\u00eda de Interacci\u00f3n Hidrof\u00edlica no es todav\u00eda una t\u00e9cnica de aplicaci\u00f3n general, en AMSbiopharma se aplican m\u00e9todos basados en esta cromatograf\u00eda para biomol\u00e9culas polares.\u00a0 Hay dos tipos de estudios en los que resulta especialmente relevante en su acoplamiento con la detecci\u00f3n por espectrometr\u00eda de masas: los estudios de<\/strong> lipid\u00f3mica<\/strong> y el an\u00e1lisis de metabolitos en estudios de metabol\u00f3mica<\/strong>.<\/a><\/p>\n De esta forma, la experiencia en desarrollo y validaci\u00f3n de m\u00e9todos basados en cromatograf\u00eda HILIC dentro de nuestros laboratorios nos permite abordar estudios con una t\u00e9cnica anal\u00edtica de vanguardia que permite realizar separaciones cromatogr\u00e1ficas extremadamente eficaces de biomol\u00e9culas estructuralmente muy similares, algo habitual en el estudio de biomarcadores<\/strong>.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"![\"\"](\"https:\/\/amsbiopharma.com\/wp-content\/uploads\/Chromatograma.jpg\")
<\/a>HILIC: una t\u00e9cnica en crecimiento<\/strong><\/h2>\n
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<\/a>Implementaci\u00f3n y ventajas:<\/strong><\/h2>\n
<\/a>C\u00f3mo aplicar HILIC de forma eficiente<\/strong><\/h2>\n
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\nNormalmente, la causa principal suele ser la falta de agua en la fase m\u00f3vil, pues esta debe contener la suficiente sustancia acuosa como para renovar la capa superficial en cada carrera. Para asegurar una re-equilibraci\u00f3n r\u00e1pida, la columna no debe utilizarse en ning\u00fan momento con fase m\u00f3vil que contenga menos de un 5% de agua..<\/span><\/li>\n
\n<\/strong>Los problemas con la reproducibilidad pueden derivar de tres casusas diferentes. Si el origen est\u00e1 en el incorrecto re-equilibrado antes de la siguiente inyecci\u00f3n, la soluci\u00f3n consiste en asegurar que la fase m\u00f3vil tenga suficiente agua para renovar r\u00e1pidamente la capa superficial en cada corrida. Si no se re-equilibra completamente, el tiempo de re-equilibrado debe ser m\u00e1s amplio.
\nPor otro lado, si el solvente de la muestra es demasiado fuerte (contenido acuoso o de alcoholes alto) y afecta a la equilibraci\u00f3n de la columna, se deber\u00e1 aumentar el contenido org\u00e1nico de los solventes de muestra y\/o reducir los vol\u00famenes de inyecci\u00f3n. Esto ayudar\u00e1 a mantener la consistencia en la retenci\u00f3n.<\/p>\n<\/a>
\nCuando se presentan dificultades a la hora de disolver la muestra, la causa suele recaer en el uso de los solventes org\u00e1nicos: son ideales para la cromatograf\u00eda HILIC, pero tambi\u00e9n pueden ser malos solventes para sales y otros analitos polares. En estos casos, lo recomendable es diluir las muestras en acetonitrilo tanto como lo permita la solubilidad y luego reducir los vol\u00famenes de inyecci\u00f3n para obtener una forma de pico aceptable y con buena reproducibilidad.<\/li>\n
\nEn problem\u00e1ticas relacionadas con la forma del pico pueden aparecer hasta cuatro causas principales. En primer lugar, puede ocurrir que los picos se dividan o arrastren debido al efecto de un volumen demasiado grande de solvente fuerte (agua) en el sistema. En estos casos, la soluci\u00f3n recaer\u00eda en intentar diluir la muestra en un solvente m\u00e1s d\u00e9bil, como el acetonitrilo.
\nPor otro lado, es posible que las muestras lleguen a arrastrarse cuando se adhieren a sitios activos en el acero inoxidable del sistema. En esos casos, hay que recordar que, si el analito es uno de los compuestos pegajosos o \u201csticky\u201d, se deber\u00e1 considerar un lavado del sistema y el uso de hardware inerte.
\nAdem\u00e1s, algunas fases HILIC, como la s\u00edlica, pueden tener interacciones secundarias de intercambio i\u00f3nico, lo que causa una retenci\u00f3n excesiva y un arrastre de aniones o cationes. Para evitar que este imprevisto ocurra, es recomendable cambiar a fases entrelazadas que no presenten estas interacciones secundarias.<\/span><\/p>\n<\/a>
\nLas dificultades que puedan aparecer con la solubilidad del tamp\u00f3n a menudo est\u00e1n directamente relacionadas con que, aunque los solventes org\u00e1nicos son necesarios para retener analitos menos polares en modo HILIC, muchos de los tampones son poco solubles. Ante esta problem\u00e1tica, se recomienda a\u00f1adir una peque\u00f1a cantidad de agua para que aumente significativamente la solubilidad del tamp\u00f3n en acetonitrilo. Concretamente, se recomienda a\u00f1adir un 10% de agua y siempre probar la solubilidad de mezclas que contengan alta concentraci\u00f3n de tamp\u00f3n con alta concentraci\u00f3n de solvente org\u00e1nico.<\/li>\n<\/ol>\nHILIC en AMSbiopharma: de Esfingol\u00edpidos a Glicanos<\/strong><\/h2>\n