Las terapias basadas en ARN han pasado de la prueba de concepto a convertirse en una clase de fármacos consolidada en menos de una década, con seis fármacos de siRNA aprobados y múltiples vacunas de mRNA actualmente comercializados. Sin embargo, la cuantificación de estas moléculas dista mucho de ser rutinaria: los medicamentos basados en oligonucleótidos, ya sean un dúplex polianiónico o un transcrito con caperuza y poliadenilado, requieren enfoques bioanalíticos diferentes, y ninguna plataforma por sí sola cubre todas las necesidades a lo largo de las fases de descubrimiento, farmacocinética (PK) y presentación regulatoria.
Retos bioanalíticos específicos de los siRNA y mRNA: inestabilidad frente a las nucleasas, selectividad de cadena y unión a la matriz
Los oligonucleótidos nativos se degradan rápidamente por acción de las exonucleasas y endonucleasas, por lo que prácticamente todos los candidatos terapéuticos basados en siRNA aprobados incorporan enlaces de fosforotioato, modificaciones 2′-fluoro o 2′-O-metilo, o un conjugado de siRNA con GalNAc para su administración dirigida a los hepatocitos. La propia cuantificación plantea además cuestiones específicas de esta modalidad:
- Selectividad de cadena: el siRNA es de doble cadena y, por lo general, para la cuantificación del siRNA solo se monitoriza la cadena antisentido (guía), ya que la cadena sentido se degrada de forma diferente y puede llegar a situarse por debajo del límite de detección.
- Unión a la matriz: una vez incorporada al complejo de silenciamiento génico inducido por ARN, la cadena antisentido se une estrechamente a Argonaute 2 (Ago2), por lo que el siRNA libre y el unido al RISC constituyen poblaciones diferenciadas.
- Complejidad específica del mRNA: de mayor tamaño que el siRNA y administrado habitualmente mediante encapsulación en nanopartículas lipídicas para la administración de mRNA, la integridad del mRNA depende no solo de la secuencia, sino también de la caperuza 5′ y de la cola poli(A) 3′, que determinan la actividad de traducción.
- Complejidad de los conjugados: los conjugados anticuerpo-siRNA incorporan un componente proteico, multiplicando el número de analitos que un programa de terapias basadas en la interferencia de ARN puede necesitar monitorizar en un único estudio de PK.
Estrategias de LC-MS/MS para la cuantificación de siRNA y mRNA: cromatografía de pares iónicos, captura por hibridación y detección
El análisis de siRNA mediante LC-MS/MS se basa habitualmente en cromatografía de fase reversa con pares iónicos (IP-RP). Un reactivo de alquilamina forma un par iónico con el hexafluoroisopropanol como contraión volátil para retener la cadena con carga negativa y permitir su detección en modo negativo.
Cuando la sensibilidad por sí sola no es suficiente, los flujos de trabajo híbridos incorporan un paso de captura antes del análisis por LC-MS: un anticuerpo o una sonda extrae primero el analito diana del suero o plasma, de modo que únicamente la cadena antisentido se eluye y cuantifica. Este mismo enfoque se extiende al bioanálisis de conjugados anticuerpo-siRNA, en el que un anticuerpo anti-conjugado captura la especie intacta y el calentamiento libera la cadena antisentido para su cuantificación. Este enfoque se ha cualificado recientemente en un estudio de PK en suero de ratón (Song & Yuan, 2025), en el que la cantidad de anticuerpo de captura, la variación entre lotes de reactivos y la temperatura de elución fueron las variables que determinaron si el ensayo mantenía un rendimiento adecuado.
La detección suele realizarse mediante uno de dos modos. El MRM (multiple reaction monitoring), estándar en los instrumentos de triple cuadrupolo, monitoriza una transición fija de precursor a fragmento y resulta adecuado para una cuantificación rápida y rutinaria una vez iniciado un estudio. La espectrometría de masas de alta resolución (HRMS, high-resolution mass spectrometry), por su parte, captura el patrón isotópico y de estados de carga completo, sacrificando algo de velocidad a cambio de la selectividad necesaria para identificar metabolitos o resolver problemas del ensayo, por lo que resulta más adecuada en las fases iniciales de un programa, cuando todavía no se han resuelto todas las cuestiones.
Comparación de plataformas bioanalíticas para terapias basadas en ARN: LC-MS/MS frente a ELISA de hibridación y RT-qPCR
Ninguna plataforma ofrece el mejor rendimiento en todos los parámetros. Las comparaciones directas realizadas utilizando el mismo analito de siRNA mediante LC-MS híbrida, SPE-LC-MS, ELISA de hibridación (HELISA) y ensayos de RT-qPCR con stem-loop para terapias basadas en ARN muestran una relación de compromiso constante:
- La LC-MS híbrida ofrece la mayor especificidad: es la única plataforma capaz de diferenciar el fármaco original de sus metabolitos. Esta precisión justifica el tiempo adicional de desarrollo cuando esta distinción es relevante.
- La SL-RT-qPCR es la más sensible y rápida de las cuatro, pero su diseño basado en cebadores no permite diferenciar el fármaco de metabolitos estrechamente relacionados.
- Los ensayos de ELISA de hibridación para siRNA se sitúan cerca de la RT-qPCR: son sensibles y rápidos, pero se basan en una sonda de captura, por lo que la especificidad y la incapacidad para detectar metabolitos constituyen el compromiso asociado a este enfoque.
- La SPE-LC-MS prescinde por completo del paso de utilización de un reactivo de captura, evitando así la validación adicional de reactivos que requieren los flujos de trabajo híbridos, aunque esta mayor simplicidad se acompaña de una menor sensibilidad que las otras tres plataformas.
Las cuatro plataformas produjeron perfiles concentración-tiempo comparables cuando se analizaron en paralelo: ninguna es simplemente «mejor» que las demás. La elección adecuada depende de las necesidades del estudio: sensibilidad, especificidad, capacidad de procesamiento o resolución de metabolitos.
Diseño de estudios de PK para terapias basadas en ARN: distribución tisular, interacción con la diana y principales parámetros bioanalíticos
La farmacocinética de los siRNA sigue un patrón distinto al de las moléculas pequeñas: un aclaramiento sistémico rápido contrasta con una acumulación tisular prolongada, especialmente en el hígado en el caso de los siRNA conjugados con GalNAc. Un estudio de PK sólido de una terapia basada en ARN suele incluir:
- Perfiles concentración-tiempo en plasma y tejidos, ya que el volumen de distribución, la semivida y la unión a proteínas varían considerablemente entre los distintos fármacos de siRNA aprobados.
- Distribución tisular del siRNA a nivel de órgano, utilizando QWBA, RT-qPCR, FISH, bDNA¹ o espectrometría de masas en función de la modalidad.
- Interacción con la diana y metabolitos: el pulldown de Ago2/RISC permite determinar si la cadena antisentido se ha incorporado realmente al complejo de silenciamiento activo y no se limita a estar presente en la muestra. El seguimiento de los metabolitos también es importante: en el caso de givosiran, su principal metabolito truncado en 3′ se ha medido en una concentración aproximadamente equivalente a la mitad de la del fármaco original.
¹ QWBA: autorradiografía cuantitativa de cuerpo entero (quantitative whole-body autoradiography); RT-qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (reverse transcription quantitative polymerase chain reaction); FISH: hibridación in situ fluorescente (fluorescence in situ hybridization); bDNA: ensayo de ADN ramificado (branched DNA assay).
Validación de métodos bioanalíticos conforme a los requisitos regulatorios para terapias basadas en ARN: requisitos de ICH M10 y soporte de CRO
Los principios de validación de métodos bioanalíticos de ICH M10 (selectividad, exactitud, precisión, efecto matriz, estabilidad y rango de calibración) se aplican a las terapias basadas en ARN del mismo modo que a cualquier fármaco químico o biológico. Sin embargo, la guía estructura la validación únicamente en torno a dos categorías: cromatografía y ensayos de unión a ligando, y ninguna de ellas contempla de forma precisa los métodos de LC-MS híbrida que combinan ambas. Esta laguna implica que los promotores deben decidir por sí mismos qué criterios son aplicables, una decisión que la propia ICH M10 contempla al recomendar a los solicitantes que consulten con las autoridades reguladoras cuando se utilice un enfoque de validación alternativo.
Tomar esta decisión correctamente es precisamente donde los programas de desarrollo de fármacos de siRNA y de desarrollo de fármacos de mRNA se benefician de una experiencia previa en este tipo de situaciones. Una CRO con experiencia en bioanálisis de oligonucleótidos que haya desarrollado y defendido métodos híbridos en distintas modalidades de ARN sabe qué elementos de validación son más relevantes para cada plataforma y cómo plantear una presentación regulatoria de siRNA y mRNA para evitar que las lagunas de la guía se conviertan en lagunas en el paquete de datos.
En AMSbiopharma, nuestro equipo de bioanálisis de ácidos nucleicos y terapia génica ofrece soporte a programas de siRNA y mRNA a lo largo de todo el ciclo de desarrollo, desde el bioanálisis preclínico temprano de PK/TK hasta la caracterización de Química, Fabricación y Controles (CMC) y las presentaciones regulatorias, mediante métodos conformes a ICH M10 en plasma, suero, tejido y líquido cefalorraquídeo (LCR).
Referencias
Agrawal K, Calliste LK, Ji S, Xu S, Ayers SA, Jian W. Comparison of multiple bioanalytical assay platforms for the quantitation of siRNA therapeutics. Bioanalysis. 2024;16(13):651-667. doi: 10.1080/17576180.2024.2350266
Jo SJ, Chae SU, Lee CB, Bae SK. Clinical Pharmacokinetics of Approved RNA Therapeutics. Int J Mol Sci. 2023 Jan 1;24(1):746. doi: 10.3390/ijms24010746
Song Z, Yuan L. A Novel Hybrid LC-MS/MS Methodology for the Quantitative Bioanalysis of Antibody-siRNA Conjugates. Anal Chem. 2025 Sep 16;97(36):19570-19577. doi: 10.1021/acs.analchem.5c02727
Thayer MB, Lade JM, Doherty D, Xie F, Basiri B, Barnaby OS, Bala NS, Rock BM. Application of Locked Nucleic Acid Oligonucleotides for siRNA Preclinical Bioanalytics. Sci Rep. 2019 Mar 5;9(1):3566. doi: 10.1038/s41598-019-40187-4
Vervaeke P, Borgos SE, Sanders NN, Combes F. Regulatory guidelines and preclinical tools to study the biodistribution of RNA therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 2022 May;184:114236. doi: 10.1016/j.addr.2022.114236.
