Todo candidato a fármaco basado en un oligonucleótido antisentido (ASO) presenta una complejidad estructural que las moléculas pequeñas nunca afrontan: un esqueleto polianiónico, una secuencia definida que debe coincidir exactamente con su diseño y un proceso de síntesis que genera impurezas que pueden diferir del producto objetivo en tan solo un nucleótido.
La confirmación de la identidad y la pureza de estas moléculas requiere una caracterización analítica de ASO basada en cromatografía de pares iónicos y espectrometría de masas de alta resolución, adaptada específicamente a las particularidades fisicoquímicas de los productos terapéuticos basados en ácidos nucleicos.
Por qué el análisis de oligonucleótidos antisentido requiere flujos de trabajo de LC-MS específicos: retos relacionados con el tamaño, la carga y las modificaciones químicas
A diferencia de los fármacos convencionales, los ASO son moléculas de gran tamaño, altamente cargadas y químicamente heterogéneas por diseño. El análisis de oligonucleótidos debe hacer frente a:
- Un esqueleto de oligonucleótido de fosforotioato, que introduce un centro quiral en cada enlace modificado, generando 2ⁿ diastereómeros para n sustituciones y ensanchando los picos cromatográficos.
- Modificaciones del azúcar 2′-MOE, 2′-fluoro o 2′-O-metilo que alteran la hidrofobicidad, el comportamiento de retención y la eficiencia de ionización por electrospray de formas que no son habituales para los analistas de moléculas pequeñas.
- Un esqueleto de fosfato con carga negativa que dificulta la retención en columnas de fase reversa convencionales sin un reactivo de pares iónicos y que forma fácilmente aductos de sodio o potasio, distribuyendo la señal entre múltiples valores de m/z y reduciendo la sensibilidad.
- Iones precursores con carga múltiple que distribuyen la señal iónica de una única especie de longitud completa en un amplio intervalo de estados de carga, lo que complica tanto la detección como la cuantificación.
Estas propiedades hacen que los métodos de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para oligonucleótidos no puedan trasladarse directamente desde plataformas desarrolladas para péptidos o moléculas pequeñas; cada parámetro, desde el reactivo de pares iónicos hasta la química de la columna, requiere una optimización específica para cada secuencia.
LC-MS/MS de fase reversa con pares iónicos para la confirmación de la secuencia y las pruebas de integridad de ASO
La cromatografía de fase reversa con pares iónicos (IP-RP) sigue siendo el modo de separación de referencia para los oligonucleótidos terapéuticos, y los métodos de oligonucleótidos mediante IP-RP-HPLC constituyen la base de la mayoría de los paquetes de caracterización destinados a presentaciones regulatorias. Un reactivo catiónico de pares iónicos, normalmente una alquilamina como la trietilamina o la hexilamina, combinado con hexafluoroisopropanol como contraión volátil compatible con MS, interacciona con el esqueleto de fosfato y aumenta la hidrofobicidad aparente, permitiendo la retención en fases estacionarias C18, fenilo o de tipo BEH.
La selectividad es altamente sensible a tres variables que interactúan entre sí: la hidrofobicidad del reactivo de pares iónicos, el modificador orgánico (metanol frente a acetonitrilo) y la propia química de la columna. Las plataformas automatizadas de cribado con múltiples columnas y múltiples fases móviles permiten ahora evaluar sistemáticamente estas combinaciones e identificar condiciones que separen shortmers, longmers y variantes de fosforotioato/fosfodiéster en una única jornada de trabajo. Una vez separados, la espectrometría de masas de ASO mediante electrospray en modo negativo confirma la secuencia del oligonucleótido mediante la correspondencia de masas exactas y, cuando se requiere una mayor resolución estructural, mediante la fragmentación por MS en tándem que permite obtener iones de tipo w y a-B.
Perfilado de metabolitos de oligonucleótidos antisentido: seguimiento de los productos de degradación y la biotransformación in vivo
Una vez administrado, un ASO experimenta una hidrólisis mediada por nucleasas en el extremo 3′ o 5′, generando una serie de especies truncadas de n-1, n-2 y de mayor longitud. Los estudios de perfilado de metabolitos de oligonucleótidos y de farmacocinética de oligonucleótidos antisentido deben distinguir estas especies del compuesto original y entre sí, ya que los metabolitos truncados en 3′ y 5′ pueden constituir pares isobáricos indistinguibles únicamente mediante MS/MS. Las vías no nucleásicas añaden una complejidad adicional: por ejemplo, los ASO conjugados con GalNAc pueden perder una, dos o tres unidades de azúcar mediante escisión enzimática, generando metabolitos que quedan fuera de las reglas de los programas convencionales de análisis dirigido y requieren un procesamiento de datos basado en la sustracción del fondo o una interpretación manual de los espectros para poder confirmarlos.
Para el análisis bioanalítico de oligonucleótidos en plasma, tejido o fracciones S9 de hígado, la preparación de muestras, ya sea mediante extracción en fase sólida, extracción líquido-líquido o captura por hibridación, debe preservar la integridad de estas especies lábiles al tiempo que elimina las interferencias de la matriz que suprimen la ionización. La combinación de una identificación dirigida mediante software con estrategias de detección no dirigida y sin sesgos aumenta las probabilidades de detectar productos de biotransformación no previstos antes de que aparezcan en fases avanzadas del desarrollo.
Caracterización de impurezas de ASO: desde secuencias fallidas n±1 hasta modificaciones químicas e impurezas relacionadas con el proceso
Las impurezas derivadas de la síntesis de oligonucleótidos se generan prácticamente en cada ciclo de acoplamiento de la química de fosforamiditas en fase sólida. Un programa sólido de análisis de impurezas de oligonucleótidos suele abordar:
- Secuencias fallidas n-1 y n+1, generadas por un acoplamiento incompleto, un capping o una pérdida prematura del tritilo, que presentan un comportamiento fisicoquímico prácticamente idéntico al del producto deseado y requieren una separación de alta resolución.
- Variantes de oxidación de fosforotioato/fosfodiéster, en las que las sutiles diferencias de hidrofobicidad requieren condiciones de pares iónicos cuidadosamente ajustadas para lograr su separación.
- Especies de deleción, con bases modificadas y diastereoméricas que se acumulan a lo largo de las distintas etapas de síntesis y purificación.
- Impurezas relacionadas con el proceso que varían a medida que disminuye la pureza de la muestra, lo que requiere condiciones que sigan proporcionando información útil en un amplio intervalo de niveles de pureza, y no únicamente para productos prácticamente finales.
Comprender el mecanismo de acción del oligonucleótido antisentido, ya sea la degradación mediada por RNasa H, la modulación del splicing o el bloqueo estérico, también permite determinar qué impurezas son relevantes desde el punto de vista biológico, ya que incluso las secuencias fallidas presentes en cantidades traza pueden tener implicaciones desproporcionadas en términos de efectos off-target o de seguridad, dependiendo de la posición que ocupe el defecto dentro de la secuencia.
Soporte de CRO analítica para terapias TIDES: expectativas regulatorias y externalización de la caracterización analítica
TIDES es el término que la propia FDA utiliza para agrupar las terapias basadas en péptidos y oligonucleótidos en sus revisiones anuales de aprobaciones, reconociendo que ambas modalidades comparten necesidades analíticas que quedan fuera del enfoque convencional de las moléculas pequeñas: una identidad definida por la secuencia, un comportamiento cromatográfico determinado por la carga y perfiles de impurezas basados en secuencias fallidas prácticamente idénticas, en lugar de en los degradantes clásicos. Las directrices de la FDA sobre oligonucleótidos también han evolucionado en paralelo a esta clasificación: una guía definitiva publicada en junio de 2024 establece expectativas específicas para esta modalidad en relación con el riesgo de QTc, la inmunogenicidad y la insuficiencia hepática/renal, mientras que un borrador de noviembre de 2024 aborda por primera vez la evaluación de la seguridad no clínica de los oligonucleótidos como un tema específico. En el ámbito bioanalítico, ICH M10 y los marcos de validación de la FDA y de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) siguen siendo aplicables, pero los promotores deben determinar qué significan la selectividad, la exactitud y la estabilidad para una molécula altamente cargada y definida por su secuencia, unos criterios que no fueron redactados teniendo en cuenta esta estructura.
Cumplir estos requisitos implica realizar estudios de cribado mediante IP-RP-LC-MS, utilizar MS de alta resolución para la confirmación de secuencias y metabolitos, y llevar a cabo un perfilado de impurezas que se adapte a los distintos lotes; una combinación de capacidades de espectrometría de masas para la caracterización de oligonucleótidos que rara vez se encuentra en un mismo centro.
Un partner de CRO analítica con experiencia en oligonucleótidos permite asumir esta complejidad en todo el ámbito de las terapias TIDES: plataformas ya validadas con diferentes químicas de pares iónicos y tipos de columnas, analistas que trabajan indistintamente en programas de péptidos y oligonucleótidos, y flujos de trabajo escalables desde la caracterización analítica inicial de ASO hasta los estudios necesarios para habilitar un IND (Investigational New Drug), sin necesidad de desarrollar estas capacidades desde cero.
En AMSbiopharma, nuestro equipo de bioanálisis de ácidos nucleicos y terapia génica ofrece soporte a programas de oligonucleótidos antisentido e interferencia de ARN mediante bioanálisis de PK/TK conforme a ICH M10 en plasma, suero, tejido y LCR, incluidos estudios de biodistribución. Para programas que abarcan todo el ámbito de las terapias TIDES, nuestros servicios de análisis de péptidos y aminoácidos incorporan la confirmación de secuencias y el peptide mapping mediante espectrometría de masas, bajo el mismo marco de calidad conforme a ICH M10.
Contacta con nosotros para conocer cómo nuestras capacidades analíticas pueden encajar en tu programa.
Referencias
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