Todo candidato a fármaco de molécula pequeña debe superar dos retos analíticos antes de llegar a una solicitud de autorización regulatoria: confirmar su identidad química y determinar su destino metabólico una vez administrado en un sistema biológico. Ambos aspectos dependen de aplicaciones de espectrometría de masas (MS) que abarcan la confirmación estructural, el control de impurezas y los estudios de metabolismo. Pocas técnicas individuales cubren una parte tan amplia del ciclo de desarrollo de un fármaco, por lo que los servicios de espectrometría de masas ocupan un lugar central en la mayoría de las carteras de servicios analíticos para la industria farmacéutica.
¿Qué tipos de servicios de espectrometría de masas se utilizan en el análisis de fármacos de molécula pequeña?
La espectrometría de masas aplicada a moléculas pequeñas en el ámbito farmacéutico abarca varias plataformas complementarias, cada una de ellas adecuada para un tipo de analito diferente:
- MS acoplada a cromatografía: la LC-MS/MS combina la cromatografía líquida, generalmente en sus modalidades de alta resolución (HPLC) o de ultraalta resolución (UHPLC), con la detección mediante espectrometría de masas en tándem, y constituye la técnica de referencia para el análisis de la pureza de los fármacos, el perfilado de impurezas y el análisis bioanalítico cuantitativo. La GC-MS, basada en la separación en fase gaseosa, sigue siendo una técnica de referencia para analitos volátiles y térmicamente estables, como disolventes residuales e impurezas genotóxicas.
- MS en tándem (MS/MS): fragmenta los iones en etapas sucesivas para obtener el nivel de información estructural necesario para la caracterización de metabolitos e impurezas.
- ICP-MS: utiliza un plasma de acoplamiento inductivo para ionizar y atomizar los elementos, lo que permite realizar ensayos de límites de impurezas elementales y metales traza que no pueden resolverse mediante las técnicas de espectrometría de masas para compuestos orgánicos.
- MS de alta resolución (HRMS): cuando es necesario establecer la identidad de un compuesto sin disponer de estándares de referencia, los analizadores de masas exactas permiten determinar directamente la fórmula molecular. Estos analizadores de masas exactas suelen emplearse en configuraciones híbridas que los combinan con un cuadrupolo para la selección de iones precursores, como Q-TOF o Q-Orbitrap, y el analizador seleccionado determina la aplicación.
Tabla 1. Comparación de los tipos de analizadores de espectrometría de masas de alta resolución utilizados en análisis farmacéutico
Más allá de estas plataformas principales, los enfoques emergentes amplían aún más el arsenal de herramientas analíticas. La MS nativa (Native MS) permite caracterizar la unión entre proteínas y fármacos en las primeras etapas del descubrimiento, la ionización ambiental (ambient ionization) posibilita un cribado rápido en condiciones ambientales y con una preparación mínima de la muestra, y la obtención de imágenes mediante espectrometría de masas (mass spectrometry imaging, MSI) permite cartografiar la distribución de un fármaco original y sus metabolitos en los tejidos.
Elucidación estructural y caracterización molecular mediante espectrometría de masas de alta resolución
La elucidación estructural en el ámbito farmacéutico aborda dos tareas estrechamente relacionadas: confirmar que un compuesto sintetizado se corresponde con la estructura prevista e identificar cualquier impureza, producto de degradación o especie inesperada presente junto a él. La espectrometría de masas de alta resolución aplicada al desarrollo de fármacos se basa en la medición de la masa exacta, a menudo con un error inferior a 5 ppm, para asignar fórmulas moleculares con un alto grado de confianza, determinando directamente la composición elemental a partir de la masa exacta sin necesidad de mediciones adicionales que requieren los sistemas de baja resolución.
La fórmula molecular permite determinar qué átomos están presentes, pero no cómo están conectados entre sí. En la práctica, los instrumentos de alta resolución operan en modo tándem, combinando la medición de masa exacta con la fragmentación en un mismo flujo de trabajo: la MS en tándem (MS/MS) fragmenta un ión precursor en iones producto que actúan como piezas de un rompecabezas para reconstruir la estructura. La disociación inducida por colisión (CID) es el método más habitual, mientras que técnicas ortogonales como la fotodisociación inducida por radiación ultravioleta (UVPD) y la disociación por transferencia de electrones (ETD) aportan información de fragmentación complementaria.
Varias capacidades permiten ampliar aún más este enfoque:
- Análisis de masa intacta establece la masa molecular del compuesto intacto como primer paso de caracterización, antes de proceder a la fragmentación.
- La espectrometría de movilidad iónica (IMS) añade una dimensión de separación basada en la conformación y la forma del ion, lo que permite distinguir isómeros que presentan espectros de fragmentación idénticos.
- Los datos de espectrometría de masas cuantitativa se combinan con frecuencia con la resonancia magnética nuclear (RMN), que aporta información sobre la conectividad entre los átomos y permite resolver la identificación de isómeros posicionales.
Es necesario emplear múltiples métodos ortogonales porque las estructuras proporcionadas por los proveedores no siempre son correctas. La caracterización de moléculas pequeñas no puede basarse en un único análisis confirmatorio, ya que una estructura asignada incorrectamente y utilizada en etapas posteriores puede invalidar los datos biológicos y regulatorios generados posteriormente.
Estudios del metabolismo de fármacos e identificación de metabolitos mediante espectrometría de masas
Una vez confirmada la estructura de un compuesto, la caracterización se centra en su destino metabólico: cómo se biotransforma la molécula una vez que entra en un sistema biológico. La identificación de metabolitos en estudios de metabolismo de fármacos ha evolucionado desde las primeras aplicaciones de LC-MS hasta los métodos actuales, dominados por la HRMS, que combinan plataformas Orbitrap o Q-TOF con cromatografía líquida y, cada vez más, con movilidad iónica, para detectar metabolitos en matrices complejas como plasma o incubaciones con hepatocitos. La mayor parte de estos estudios comienza in vitro, mediante incubaciones con microsomas hepáticos y cofactores de las reacciones de fase I y fase II, que permiten reproducir las principales vías metabólicas.
El perfilado de metabolitos de fármacos tiene dos objetivos. Por un lado, identificar de forma temprana las posiciones susceptibles de sufrir transformación metabólica (metabolic soft spots) para orientar el rediseño de análogos posteriores. Por otro, caracterizar cualquier metabolito activo, reactivo o tóxico que pueda tener implicaciones para la seguridad. Las dos funciones de la MS en tándem permiten abordar ambos objetivos: los estudios dirigidos de metabolismo de fármacos mediante LC-MS/MS en instrumentos de triple cuadrupolo permiten cuantificar metabolitos conocidos, mientras que la HRMS permite identificar metabolitos desconocidos.
Junto con los ensayos de estabilidad metabólica mediante espectrometría de masas, estos análisis proporcionan información clave para orientar los programas de química medicinal sin necesidad de disponer de un estándar de referencia para cada metabolito. Determinar con precisión el sitio exacto de transformación metabólica en la molécula suele ser el paso más complejo. La disociación inducida por colisión (CID) convencional no siempre proporciona información suficiente, especialmente en el caso de la glucuronidación, donde técnicas como la disociación activada por electrones (EAD) permiten resolver la asignación estructural.
Aplicaciones de la espectrometría de masas a lo largo del ciclo de desarrollo de un fármaco
El papel de la espectrometría de masas cambia a medida que un compuesto avanza desde la fase de descubrimiento hasta su comercialización: tiene un papel predominante durante las primeras etapas de desarrollo, pero se limita progresivamente a aplicaciones específicas en el control de calidad rutinario, donde un único método bien caracterizado suele ser suficiente para un fármaco de molécula pequeña. Las aplicaciones de espectrometría de masas más relevantes para la caracterización de moléculas pequeñas se concentran en varias fases:
- Descubrimiento y cribado de candidatos: la metabolómica basada en espectrometría de masas permite establecer relaciones entre el genotipo y el fenotipo mediante biomarcadores de moléculas pequeñas, mientras que métodos de alto rendimiento como la espectrometría de masas con eyección acústica (AEMS) aceleran el cribado y la caracterización inicial de los procesos de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME).
- Perfilado ADME y farmacocinético: la combinación de cromatografía y espectrometría de masas permite monitorizar cada uno de los procesos ADME con una elevada sensibilidad, mientras que la obtención de imágenes mediante espectrometría de masas (MSI) permite determinar cómo se distribuye un fármaco original y sus metabolitos en los tejidos, extendiendo su aplicación al ámbito de la toxicología, donde esta información espacial contribuye a la evaluación de la seguridad.
- Ámbito clínico y control de calidad: la LC-MS/MS constituye el estándar de referencia para la monitorización terapéutica de fármacos, proporcionando la especificidad y la capacidad de cuantificación multianalito que sustentan la dosificación personalizada, y desempeña además un papel fundamental en los ensayos de liberación y estabilidad que respaldan las solicitudes de autorización regulatoria.
Elección de una CRO analítica para servicios de espectrometría de masas: capacidades, estándares regulatorios y flujos de trabajo
Pocos promotores pueden mantener internamente todas las plataformas que necesita un programa de desarrollo de moléculas pequeñas, junto con la experiencia en desarrollo de métodos que requiere cada una de ellas. Un socio CRO analítico especializado en espectrometría de masas cubre esta necesidad, adaptando los métodos a cada etapa del desarrollo y validándolos para que cumplan los requisitos necesarios ante las revisiones de la FDA y la EMA. Además, centralizar el análisis estructural, la identificación de metabolitos y los ensayos de impurezas en un único proveedor evita las transferencias entre proveedores que pueden ralentizar el desarrollo de un programa.
En AMSbiopharma, nuestros servicios de caracterización de fármacos mediante espectrometría de masas abarcan el análisis estructural de moléculas pequeñas, la identificación de metabolitos y los ensayos de sustancias farmacológicas, combinando técnicas avanzadas de UHPLC-MS/MS, GC-MS, HRMS e ICP-MS con el desarrollo de métodos alineados con los requisitos regulatorios.
Referencias
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